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細(xì)胞周期檢測(cè)（流式細(xì)胞術(shù)）

發(fā)布時(shí)間： 2022-10-18　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2347次

原理

流式細(xì)胞周期檢測(cè)是一種常見(jiàn)的檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的方法之一，細(xì)胞在不同周期時(shí)，其內(nèi)的DNA含量不同。碘化丙啶（PI）作為一種核酸嵌入型染料，能夠進(jìn)入固定后的細(xì)胞中，與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，從而判定不同組別中細(xì)胞周期發(fā)生的變化。

用途

檢測(cè)不同組別或處理對(duì)某種細(xì)胞周期的改變。

材料與儀器

【器材】
流式細(xì)胞儀、移液器、槍頭、離心管、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、水浴鍋、流式管、濾頭；
【試劑】0.25％胰蛋白酶溶液、PBS、RNA酶、PI染液、70％乙醇溶液（建議提前放入負(fù)二十預(yù)冷）；

步驟

1.以腫瘤細(xì)胞為例，將正常生長(zhǎng)的對(duì)照或處理組腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組取2×105-3×105個(gè)細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞貼壁后，將正常培養(yǎng)基替換為無(wú)血清1640培養(yǎng)基，同步化20 h，使得所有細(xì)胞都進(jìn)入相同的細(xì)胞周期時(shí)期；同步完后，將培養(yǎng)基重新替換為正常含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；

2.用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化，收集細(xì)胞，300 g，離心3 min；用吸引器去除培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次，再次300 g，離心3 min；去除PBS，用提前預(yù)冷的70%酒精重懸細(xì)胞沉淀，4℃固定過(guò)夜；

3．4℃，1000 g，離心3-5 min，去除酒精，用PBS清洗3遍，最后一遍去除PBS；加入300 μL PBS，輕輕吹打，重懸細(xì)胞沉淀，加入相應(yīng)量的Rnase至終濃度100 μg/mL，37 ℃水浴鍋中消化30 min；

4．上機(jī)前加入PI（5 mg/mL）至終濃度50 μg/mL，避光孵育15 min；孵育完后，過(guò)300目細(xì)胞篩，上機(jī)檢測(cè)；

5.分析數(shù)據(jù)。

注意事項(xiàng)

1. PI為致癌物質(zhì)，避免用手直接接觸。

2. 細(xì)胞數(shù)目應(yīng)該達(dá)到2x104個(gè)，細(xì)胞數(shù)目過(guò)少影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.鋪板的細(xì)胞數(shù)量以收獲細(xì)胞時(shí)有足夠的生長(zhǎng)空間來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，現(xiàn)在的流式細(xì)胞儀靈敏度很高，不需要太多的細(xì)胞。

4. 在制備時(shí)，要清洗干凈酒精，特別注意清洗過(guò)程中細(xì)胞的損失。離心次數(shù)不宜過(guò)多，防止細(xì)胞丟失。

5. 可以用未處理的細(xì)胞調(diào)試流式細(xì)胞儀。

6.胰酶不加EDTA

常見(jiàn)問(wèn)題

Q:酒精固定后細(xì)胞難以沉淀下來(lái)，導(dǎo)致細(xì)胞丟失較多；
A:可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速。

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