• 總有一種轉(zhuǎn)染方法適合你

  
  

一、

怎樣提高細胞的轉(zhuǎn)染效率?有的同學做了轉(zhuǎn)染，連接目的基因的載體帶熒光，轉(zhuǎn)染后48小時在熒光顯微鏡下觀察，卻發(fā)現(xiàn)只有約百分之15左右的熒光，問該怎么提高轉(zhuǎn)染效率?有沒有必要接著往下做篩選?還是重新轉(zhuǎn)染一次?

1、

如果要是做穩(wěn)定篩選的話，15%的轉(zhuǎn)染率應該夠了。

提高轉(zhuǎn)染效率的話，可以適當降低轉(zhuǎn)染時細胞的密度(我試過60～70%的密度比90%更好一些)，另外還有可能就是細胞的生長狀態(tài)，還有在接種后24h內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。

2、

轉(zhuǎn)染應該在對數(shù)生長期內(nèi)進行才能保證轉(zhuǎn)染效率，因為該時期細胞生長狀態(tài)良好，容易吸收外源質(zhì)粒，而不同細胞株的對數(shù)生長期是有差異的，因此建議先繪制培養(yǎng)細胞的生長曲線、確定其對數(shù)生長期，然后再著手做轉(zhuǎn)染。

二、

有同學用293細胞包裝病毒，轉(zhuǎn)染有熒光(約百分之二十)，但是感染總是沒有熒光，感染細胞狀態(tài)很好，第四天后開始變圓脫落。轉(zhuǎn)染后的細胞沒有抗性，不能篩。

1、

20%的轉(zhuǎn)染率太低了，一般用293T包裝慢病毒轉(zhuǎn)染率達到80%以上.轉(zhuǎn)染率太低和293T的代數(shù)有關(guān)系，還和質(zhì)粒的濃度和純度有關(guān)系。

2、

轉(zhuǎn)染的前一天將細胞傳代，根據(jù)你的細胞生長速度，傳成適當?shù)拿芏龋ＷC第二天細胞達到70%左右，做轉(zhuǎn)染。有的人用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，由于脂質(zhì)體對細胞有毒性作用，細胞特別容易脫落，所以防止細胞脫落，是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。

3、

轉(zhuǎn)染的效率根本上還是由細胞種類決定的，有些細胞系好轉(zhuǎn)，效率高，有些就不怎么好了。但是我們還是可以盡可能的提高轉(zhuǎn)染效率，之前提過，細胞生長狀態(tài)要好，這個很重要。另外，每種細胞系都有自己的最好用的轉(zhuǎn)染試劑，要多看文獻知道這種細胞系用哪種轉(zhuǎn)染試劑最多。然后自己可以按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做個曲線，看看reporter的表達效率，做到好的轉(zhuǎn)染效率。其實DNA的質(zhì)量也很重要，不僅僅是內(nèi)毒素影響細胞的生存，一般情況下DNA超螺旋最好比列越高越好。為了促進表達，轉(zhuǎn)染前線性化也可以。

如果有些細胞系確實難轉(zhuǎn)，就應該考慮其他方法了，電穿，病毒之類的。amaxa的nucleofector可以直接把質(zhì)粒打到核里，很好用。

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